Therapeutic effects and its mechanism of lithium in spinal cord injury

Abstract

A 4-year-old male miniature poodle developed chronic progressive paraplegia of the hind limbs following an accident 2 years prior to presentation for treatment. All hematological parameters, including the complete blood count, were normal. Neurological examination revealed that the dog was ambulatory, with severe ataxia of the hindlimbs. Radiological examination showed a fracture of the 10ththoracic vertebra in the lateral view. The bladder was expanded, and the gas shadow in the stomach was elevated. Computed tomography revealed a fracture in the 10th thoracic vertebra in the sagittal and coronal views, and lack of continuity of the thoracic vertebrae. We diagnosed complete transection of the spinal cord, and postulated that connective tissue injury in the damaged spinal cord was followed by permanent paralysis. The hematological parameters were in the normal range, although there might have been transient changes immediately after the spinal cord injury (SCI). A therapeutic trial is recommended only within a few days after SCI in cases with potential for improvement.

Glycogen synthase kinase (GSK)-3β and related enzymes are associated with various forms of neuroinflammation, including spinal cord injury (SCI). Our aim was to evaluate whether lithium, a non-selective inhibitor of GSK-3β, ameliorated SCI progression, and also to analyze whether lithium affected the expression levels of two representative GSK-3β-associated molecules, nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf-2) and heme oxygenase 1 (HO-1) (a target gene of Nrf-2). Intraperitoneal lithium chloride (80 mg/kg/day for 3 d) significantly improved locomotor function at 8 d post-injury (DPI); this was maintained until 14 DPI (p < 0.05). Western blotting showed significantly increased phosphorylation of GSK-3β (Ser9), Nrf-2, and the Nrf-2 target HO-1 in the spinal cords of lithium-treated animals. Fewer neuropathological changes (e.g., hemorrhage, inflammatory cell infiltration, and tissue loss) were observed in the spinal cords of the lithium-treated group compared with the vehicle-treated group. Microglial activation (evaluated by measuring the immunoreactivity of ionized calcium-binding protein 1 [Iba-1]) was also significantly reduced in the lithium-treated group. These findings suggest that GSK-3β becomes activated after SCI, and that a non-specific enzyme inhibitor, lithium, ameliorates rat SCI by increasing phosphorylation of GSK-3β and the associated molecules Nrf-2 and HO-1.

척수손상(SCI)은 기계적 및 염증반응에 의해 유발되는 손상을 특징으로 하며, 병리학적으로 부종, 축삭변성, 염증세포침윤, Fibronectin의 삼출 등을 특징으로 한다. 임상에서 척수손상은 대부분 외상성 손상에 의해 발생하며, 내원한 증례의 경우에도 밟힘에 의하여 후지마비 증상을 보였다. 혈액검사에서는 백혈구증가증의 소견을 보였고, 신경검사에서는 Proprioception 등에서 후지의 마비를 확인하였으며, 영상학적 검사에서는 Sagittal view에서 흉추10번의 골절을 확인하였고 Coronal view에서 흉추10번의 척수강 내 붕괴가 확인되었다. Glycogen synthase kinase (GSK) -3β 및 이와 관련된 효소는 척수 손상 (spinal cord injury: SCI)을 비롯한 다양한 형태의 신경 염증과 관련 되어있다. 전통적으로 양극성 신경질병의 치료제로 쓰이는 리튬은 최근 여러 연구에서 척수손상 후 신경원세포를 보호하고 신경 발생을 자극하며, 세포사멸을 억제하는 것으로 알려졌다. 본 연구에서는 GSK-3β의 비선택적 억제제인 리튬을 이용하여 랫트의 압박성 척수손상모델에서 효능을 평가하였다. 또한 그 기전연구로 GSK-3β 관련 분자이며, 산화적 손상을 억제시켜 세포를 보호하는 것으로 알려져 있는 nuclear factor erythroid 2-related factor-2 (Nrf-2) 및 그 표적 단백질인 heme oxygenase-1 (HO-1)의 변화를 확인하였다. 랫트의 8-10번 흉추골을 절단하여 척수를 노출시킨 후, 혈관 클립을 이용하여 1분 동안 척수를 압박하는 방법을 이용하여 척수손상 모델을 유도하였고, 수술 후 뒷다리의 완전 마비가 유도된 랫트를 선별하여 대조군과 리튬 투여군으로 나누어 행동학적 평가, 조직학적 평가, 면역조직화학적 평가, Western blot analysis을 진행하였다. 행동학적 평가에서는 Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) score와 sciatic functional index test 방법을 변형하여 보행정도를 평가하였고, 대조군과 리튬 투여군 모두 손상 후 3일부터 회복하기 시작하여 손상 후 8일부터는 대조군에 비해 리튬 투여군이 유의성 있게 행동학적 차이를 보였으며 손상 후 14일까지 유지되었다 (p <0.05). 보행형태는 손상 직후에는 발등을 끄는 형태의 보행을 나타내다가 리튬 투여 후 3일째부터 보행정도가 점차 발바닥에서 발가락으로 옮겨 보행하는 형태를 확인할 수 있었다. 조직학적 평가에서는 척수손상 후, 척수 조직 내 출혈, 염증세포의 침윤 및 조직의 손실되었으나, 리튬을 투여한 경우에는 이러한 조직학적 소견이 향상되었다. 이러한 조직학적 소견을 바탕으로 척수 조직 내 염증정도를 확인 할 수 있는 microglia의 활성정도를 ionized calcium-binding protein-1 (Iba-1) 항체를 이용하여 면역염색을 실시한 결과, 리튬을 투여한 경우에 microglia 양성세포의 수가 감소되었을 뿐만 아니라, 웨스턴 블럿을 이용하여 그 양을 측정한 경우에도 유의성 있게 감소되었음을 확인하였다. 또한 리튬은 억제성 GSK-3β의 인산화와 Nrf-2의 핵내 발현을 증가시켰고, 표적단백질은 HO-1의 발현도 증가시켰다. 이는 척수손상으로부터 산화적 손상을 리튬이 완화시켰음을 의미한다. 본 연구는 리튬이 척수손상이 유도된 랫트의 마비를 개선시켰고, 척수손상에 의한 염증세포의 침윤 및 조직 내 출혈, 조직의 손실을 완화시켰으며, GSK-3β의 억제, Nrf-2의 핵 전이 증가로 인한 표적 단백질인 HO-1의 활성화를 통해 신경세포를 산화적 손상으로부터 보호하는 효과가 있었다. 이러한 리튬은 척수손상의 치료에 보조적인 역할을 할 것으로 기대된다.